SDR是否可以測(cè)量外部代謝產(chǎn)物對(duì)葉片O 2消耗率的影響。具體而言,先前在代謝物對(duì)葉片O 2消耗速率的影響(使用Astec Global的Q2)中進(jìn)行了觀察,觀察到10 mM脯氨酸(Pro)在14小時(shí)內(nèi)引起大約兩倍的呼吸速率刺激。該測(cè)量的關(guān)鍵方面是持續(xù)時(shí)間(> 14小時(shí))及其動(dòng)態(tài)性質(zhì),因?yàn)槲覀儗?duì)速率隨時(shí)間的變化感興趣。我采用了SDR設(shè)置,因此可以測(cè)量包含樣品的試管頂部空間中的氧氣。
背景:需要進(jìn)行植物呼吸測(cè)量
呼吸通量和光合速率是常規(guī)適用于植物的代謝通量測(cè)量方法,因此兩者都是了解植物生物化學(xué)和理學(xué)的關(guān)鍵工具。當(dāng)前存在幾種可以測(cè)量植物呼吸氣體交換速率的技術(shù),例如用于CO 2的紅外氣體分析儀和用于氧氣的Clark型O 2電極。兩種技術(shù)都具有低通量和持續(xù)時(shí)間短的測(cè)量技術(shù),這阻礙了大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),例如,這些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將用于植物育種者。澳大利亞研究委員會(huì)植物能量生物學(xué)中心(PEB)一直處于開發(fā)和試用用于植物的新呼吸測(cè)量技術(shù)的前沿。具體來說,使用O2依賴于熒光的猝滅已被用于多種高通量技術(shù),例如SDRSensorDish®Reader,Seahorse或Astec Global的Q2。然而,在植物科學(xué)中很少使用這些技術(shù),特別是海馬使用漂浮的植物組織的應(yīng)用受到限制[1]。盡管我們已經(jīng)嘗試過將標(biāo)準(zhǔn)SDR與先前帶有傳感器斑點(diǎn)的玻璃板結(jié)合使用,但是斑點(diǎn)在井底的位置與涉及液體和頂部空間的測(cè)量不兼容。目前,PEB的許多呼吸研究均依賴于第二季度。該機(jī)器基本上使用自己版本的傳感器點(diǎn),這些傳感器點(diǎn)位于頂部螺旋管的蓋子和自動(dòng)傳感器臂中。Q2可以很好地與各種植物組織配合使用,并且可以大大提高測(cè)量能力,如Scafaro et al。,2017 [2]中所評(píng)估。簡(jiǎn)單的管和蓋設(shè)置也適用于液體介質(zhì)的測(cè)量。這是一個(gè)很大的優(yōu)勢(shì),因?yàn)樗试S將化學(xué)物質(zhì)引入呼吸測(cè)定法,從而大大擴(kuò)展了其用途[3]。因此,我想測(cè)試SDR是否可以與Q2搭配類似的設(shè)置(帶有管和傳感器點(diǎn)帽),以及它是否具有*的測(cè)量性能。
圖1:SDRSensorDish®閱讀器設(shè)置,用于葉盤呼吸測(cè)量。將葉片切開并漂浮在固定在底部架子上的螺帽管內(nèi)的緩沖介質(zhì)上。旋緊瓶蓋。頂部機(jī)架適配器已放置在上面。特別提款權(quán)倒掛。
材料與方法
實(shí)驗(yàn)設(shè)置簡(jiǎn)單,快速(圖1)。當(dāng)總?cè)萘繛?56 µL的塑料螺帽管充滿600 µL緩沖溶液(50 mM HEPES,10 mM MES,200 µM CaCl 2,pH 6.6)在存在或不存在10 mM Pro(或所需的任何其他化學(xué)物質(zhì))的情況下,留有256 µL的空氣頂空。將7毫米的葉盤打孔并漂浮在溶液上,并蓋上管蓋(n = 10)。所有測(cè)定中均應(yīng)包括無葉盤的空白試管,因?yàn)樗鼈儽仨毴コ罅勘尘霸胍舨⑻岣邤?shù)據(jù)質(zhì)量。然后使用兩個(gè)3D打印適配器(PreSens)組裝SDR。一個(gè)SDR大約需要15分鐘的設(shè)置時(shí)間。提供的蓋子和管子是高質(zhì)量的。考慮到適配器的小設(shè)計(jì),該單元的組裝非常堅(jiān)固。在室溫下黑暗中收集氧氣數(shù)據(jù)。該測(cè)定以15秒的間隔進(jìn)行過夜(?17小時(shí))。數(shù)據(jù)已導(dǎo)出到Excel進(jìn)行分析。
結(jié)果
圖2顯示了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的氧氣測(cè)量結(jié)果,該實(shí)驗(yàn)比較了用SDR記錄的未經(jīng)處理的葉片與經(jīng)過Pro處理的葉片。這些值用于進(jìn)一步的消耗率計(jì)算。我通過減去無葉盤的空白試管中的平均消耗率來校正O 2消耗率隨時(shí)間的變化。然后將速率計(jì)算為移動(dòng)1.5小時(shí)窗口(圖3A-B)。O 2消耗率軌跡隨時(shí)間的平滑度是用于計(jì)算移動(dòng)斜率的時(shí)間窗口的函數(shù):更大的窗口等于更平滑的軌跡。但是,出于本實(shí)驗(yàn)的目的,空白消減后殘留的噪聲不是一個(gè)因素。根據(jù)Scafaro等人的方法,將O 2百分比轉(zhuǎn)換為摩爾值。2017 [2]。
圖2:用SDR記錄的未經(jīng)處理(左)和經(jīng)過Pro處理(右)葉盤的氧氣測(cè)量值。一個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。經(jīng)Pro處理的葉盤的刺激呼吸清晰可見。
結(jié)果表明,SDR板與管和蓋的設(shè)置相結(jié)合,再現(xiàn)了以前使用Q2獲得的結(jié)果。對(duì)照葉片中O 2的消耗率隨時(shí)間逐漸下降(圖3A,C)。在Pro處理過的圓盤中,如預(yù)期的那樣,從開始孵育4小時(shí)開始,O 2消耗率隨時(shí)間增加(圖3B,C,D)。在圖3D中,我們比較了兩種不同的擬南芥基因型。該測(cè)定法能夠通過重復(fù)六次檢測(cè)先前觀察到的品系間表型差異。
資料品質(zhì)
關(guān)鍵因素是測(cè)量之間的技術(shù)差異。與其他呼吸測(cè)量設(shè)備相比,對(duì)照治療的重復(fù)痕跡顯示出較低的技術(shù)變異:變異系數(shù)為22.7%(其中包括生物學(xué)變異,因此潛在的技術(shù)變異更低)。較低的CV至關(guān)重要,因?yàn)樗勾_定具有合理重復(fù)次數(shù)的樣品類型之間的差異變得更加容易。在Pro處理過的葉盤中,由于生物變化,對(duì)Pro的響應(yīng)在葉盤中不太均勻,因此可以預(yù)料到Pro處理過的葉盤中O 2消耗率的變化會(huì)增加。
15 s的測(cè)量頻率足以解決數(shù)據(jù)中隨時(shí)間變化的模式。通過將設(shè)備放置在培養(yǎng)箱中來控制溫度的能力是植物呼吸研究的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)。
圖3:暴露于外源性化學(xué)物質(zhì)時(shí)葉盤中O 2消耗率的測(cè)定。在有或沒有10mM Pro的條件下孵育擬南芥葉盤,并在約15小時(shí)的黑暗中測(cè)量O 2耗竭率。通過減去含有緩沖液但沒有葉盤的四個(gè)試管的平均速率來校正速率。(A,B)對(duì)照和Pro處理的WT葉盤的單個(gè)跡線(n = 10)。(C)來自A和B的平均跡線。(D)來自Pro和對(duì)照處理的WT和突變株的平均跡線,相對(duì)于未處理的WT速率顯示(n = 6)。突變株顯示出部分缺乏Pro的呼吸刺激。